针对中晚期患者，如果HER2扩增FISH检测组织不可及或检测失败，可更换为dPCR平台或者NGS平台检测外周血样本，让患者最大可能的获益于靶向治疗。

  荧光原位杂交（fluorescence in situhybridization，FISH）是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测技术。FISH大多数都用在病理的辅助诊断及鉴别诊断、疾病预后评估和指导临床靶向治疗等，是近十年来在临床病理检测中运用最为广泛的一种分子细胞遗传学诊断技术。

  通俗来讲，FISH检测是指应用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交，在荧光显微镜下观察并记录结果。

  FISH检测是在制备好的石蜡防脱切片上进行的，主要流程包括：预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节[1]。

  烤好的组织切片需经过脱蜡处理。二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等，影响实验结果。

  1、切片预处理：在现阶段，预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离子水等；处理方法有高温水浴、高温度高压力等；预处理温度50～120℃不等。处理程序会因组织类型不同而有差异。

  2、酶消化处理：对切片进行酶消化，常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶和蛋白酶K。酶消化的作用是分解包围靶DNA的蛋白质，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。酶消化需要注意的几点：①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，细胞核消失或细胞核辨认不清，也会造成某些特定的程度的组织脱片；②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻，降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率；③消化酶均为现用现配，且工作液使用时间24小时。

  3、梯度乙醇脱水：将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水，自然晾干。需要注意的几点：切片必须充分脱水晾干，避免造成信号减弱或者杂交失败。

  变性和杂交分为甲酰胺变性杂交（手工操作）和杂交仪变性杂交（自动操作）。前者是将组织切片和探针分开进行变性，后者是在杂交仪中对组织切片和探针共变性，此办法能够在某些特定的程度上降低人的因素的影响。根据所选用厂家探针的要求，设定共变性杂交条件，可选变性温度和时间：72～95℃，3～5分钟，杂交温度和时间：37或42℃，16～18小时。需要注意的几点：为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

  杂交后处理的目的：①洗去多余的未结合的探针；②洗去非特异度结合的探针片段，大大降低杂交背景。杂交后洗涤一般遵循的共同原则：盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。需要注意的几点：①在漂洗的过程中，切勿使切片干燥；②影响洗涤的因素有：洗液中NP-40的浓度、洗涤时间、洗涤温度、洗液pH值。

  在杂交区域位置滴加足够量的DAPI复染剂，立即盖上盖玻片，-20℃冰箱内存放。需要注意的几点：①4,6-二咪基-2-联苯基吲哚（DAPI）是一种毒性物质与致癌物，操作的流程中应注意个人保护措施。如不慎接触，立即大量水冲洗。②注意避光，紫外线会造成荧光淬灭。③宜选用较大盖玻片或是选用指甲油在盖玻片四周封片。可以有很大成效避免阅片时镜油的渗入对信号观察的影响。荧光原位杂交结果应立即照相存档并将切片置于-20℃保存，建议至少保存3个月备查，有条件的可以保存1年以上，仍可见清晰信号。

  由此可见，FISH检测步骤繁琐，尤其是直接送检新鲜组织的，还需进行石蜡包埋等。那么当我们拿到报告的时候，图片上的红点和绿点分别代表什么呢？阳性和阴性结果又是怎么样来判断的呢？

  在临床上，FISH检测相关特异性位点可帮助患者指导用药、评估预后以及辅助诊断等。例如，HER2基因扩增的乳腺癌患者显著受益于抗HER2治疗，且HER2基因扩增与乳腺癌患者预后差相关。当患者确诊为乳腺癌时，一般会常规进行HER2 IHC（免疫组化检测），图2是2023 CSCO乳腺癌诊疗指南针对HER2 IHC的具体判读方法：

  从图2能够正常的看到，HER2 IHC 2+的患者的HER2状态要进一步通过FISH检测来进一步确定。那么FISH检测结果又是如何判读的呢？

  乳腺癌HER2 FISH检测是采用双探针法进行仔细的检测的，检测结果需要在少数的肿瘤细胞中进行判读。图3中的绿色信号数反映了17号染色体（CEP17）的数量，红色信号数反映了HER2基因的拷贝数。依据NCCN乳腺癌指南判读标准，FISH结果必要时需结合IHC结果综合评估，具体判读标准如下：

  值得注意的是，《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》提到，若众多HER2信号连接成簇时，可直接判断为FISH阳性。

  另外，针对胃癌、尿路上皮癌HER2基因扩增FISH检测，国内外指南和专家共识也给出相应的判读标准：

  图6：NCCN胃癌指南专家组建议，应首先进行HER2 IHC，然后对于IHC显示2+(不确定)的胃癌病例，进行ISH。HER2 IHC结果阳性(3+)或阴性(0或1+)不要进一步的ISH检测。HER2:CEP17比值≥2或HER2平均拷贝数≥6.0个信号/细胞的病例应考虑为ISH/FISH阳性。

  图7：来自《中国尿路上皮癌人表皮生长因子受体2检测临床病理专家共识 2021年10期》

  当然，在进行仔细的检测之前，我司实验室会对样本做质控。通常情况下，FISH检测质控不合格的原因包括石蜡切片脱片，由于背景信号过高、FISH信号不合格等。

  1、组织自身原因及处理不当，组织中富含血液成分、脂肪成分或者组织过硬，如干涸、坏死或者骨组织；

  2、组织取材切片过厚（超过37.5px X 37.5px X 7.5px），造成组织固定、脱水、透明不足，石蜡切片浸入不足或者不能浸入，勉强包埋，制片时切出的切片经过烤片、脱蜡、染液等步骤后易脱落；

  3、组织脱水过程原因，程序设置不合理，脱水过程中无水乙醇和二甲苯的处理时间过长，温度过高或者石蜡长时间未更换；

  4、制片过程中，切片破碎、有褶皱或烤片时间过短、温度过低及载玻片不洁净清晰度不佳等；

  1、前期固定步骤对FISH的结果影响很大，固定不足会导致信号丢失，固定时间过长，难以消化背景太高，手术的组织样本没有立即做固定，导致组织固定不及时，也会导致FISH信号差；

  2、组织切片的厚度在4~5um厚，过厚或者过薄的切片均对信号的强弱产生一定的影响，而且切片应保持组织完整，质量良好，并使用阳离子专用载玻片，否则在预处理环节会出现脱片；

  3、对于肿瘤复发的病人，需要追溯并和原发肿瘤或原来的手术后组织块作比较，可能遇到石蜡包埋的组织块存放超过2年甚至更长时间；

  5、消化不足会导致信号弱，组织界限不清，过度消化会导致细胞破碎，信号丢失。

  众多国内外指南和专家共识均推荐，可获取肿瘤组织的乳腺癌患者采用IHC检测HER2受体蛋白的水平，采用FISH检测HER2基因的扩增水平，且IHC联合FISH检测是金标准。然而部分患者因组织样本不可得，而没有办法进行IHC和FISH检测，或者因组织样本处理欠规范等多种原因，导致IHC和FISH检测失败，这些患者可能错失靶向治疗的机会。

  《外周血HER2基因扩增检测（数字PCR法）在抗HER2治疗中的应用共识》提到，组织样本检测结果阴性或组织样本不可得的初治晚期或复发转移乳腺癌患者，可使用dPCR法检测外周血样本中的HER2基因状态。dPCR法检测HER2基因状态可用于乳腺癌患者抗HER2治疗的伴随诊断和抗HER2治疗过程中的动态监测。另外，该检测的新方法也适用于其他肿瘤患者抗HER2治疗的检测需求，检测样本类型为肿瘤组织或者外周血样本。

  一项临床试验结果为，从转移性乳腺癌患者ctDNA中检测HER2基因状态，与组织检测结果相比，它的灵敏度可达79%，特异度为100%。这不仅说明肿瘤液体活检的必要性，也是肿瘤液体活检测检作为伴随诊断的有力证据[2]。

  针对乳腺癌患者，NCCN指南除了推荐进行HER2基因扩增检测，还推荐了HER2突变、BRCA1/2突变、PALB2突变、PIK3CA突变、ESR1突变、NTRK融合、RET融合、MSI和TMB等分子检测。基于NGS的大panel检测可覆盖上述分子指标，检测多基因、多变异类型，全面指导患者靶向、免疫治疗，评估预后和遗传风险等。另外，基于NGS平台检测的项目，有组织样本尽量送检组织样本做检测，组织不可及的中晚期患者，还可次选外周血样本进行仔细的检测。

  一项回顾性单研究搜集了纪念斯隆凯特琳癌症中心自2009年1月1日至2019年9月30日期间经HER2 IHC结果不确定的浸润性乳腺癌，回顾了同一组织样本的FISH和NGS检测（MSK-IMPACT）数据。该研究根据结果得出，可将NGS作为FISH检测HER2扩增的替代方案。另外研究表示，与FISH方法学相比，NGS不但可以准确检测HER2扩增，同时可提供丰富的基因突变信息，具有更广泛的指导意义[3]。

  因此，针对中晚期患者，如果HER2扩增FISH检测组织不可及或检测失败，可更换为dPCR平台或者NGS平台检测外周血样本，让患者最大可能的获益于靶向治疗。